Хвала вам што сте посетили nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену CSS подршку. За најбоље искуство, препоручујемо да користите најновију верзију прегледача (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). Поред тога, како бисмо осигурали континуирану подршку, ова страница неће садржати стилове и JavaScript.
Скелетни мишић је хетерогено ткиво састављено претежно од миофибрила, који се код људи типично класификују у три типа: један „спор“ (тип 1) и два „брза“ (типови 2А и 2X). Међутим, хетерогеност између и унутар традиционалних типова миофибрила остаје слабо схваћена. Применили смо транскриптомске и протеомске приступе на 1050 и 1038 појединачних миофибрила из људског vastus lateralis, респективно. Протеомска студија је обухватила мушкарце, а транскриптомска студија 10 мушкараца и 2 жене. Поред изоформи тешких ланаца миозина, идентификовали смо метаболичке протеине, рибозомске протеине и ћелијске спојне протеине као изворе вишедимензионалне варијабилности интермиофибрила. Штавише, упркос идентификацији кластера спорих и брзих влакана, наши подаци сугеришу да се влакна типа 2X фенотипски не разликују од других брзотрзајућих влакана. Штавише, класификација заснована на тешким ланцима миозина није довољна да опише фенотип миофибрила код немалинских миопатија. Генерално, наши подаци указују на вишедимензионалну хетерогеност миофибрила, са изворима варијација који се протежу изван изоформи тешког ланца миозина.
Ћелијска хетерогеност је инхерентна карактеристика свих биолошких система, што омогућава ћелијама да се специјализују како би задовољиле различите потребе ткива и ћелија.1 Традиционални поглед на хетерогеност влакана скелетних мишића је да моторни неурони дефинишу тип влакана унутар моторне јединице и да је тип влакана (тј. тип 1, тип 2А и тип 2X код људи) одређен карактеристикама изоформи тешког ланца миозина (MYH).2 Ово је у почетку било засновано на њиховој pH АТПазној нестабилности,3,4 а касније на њиховој молекуларној експресији MYH.5 Међутим, са идентификацијом и накнадним прихватањем „мешовитих“ влакана која коекспресују више MYH у различитим пропорцијама, влакна скелетних мишића се све више посматрају као континуум, а не као различити типови влакана.6 Упркос томе, област се и даље у великој мери ослања на MYH као примарни класификатор за класификацију миофибрила, став који је вероватно под утицајем ограничења и значајних пристрасности раних студија на глодарима чији се профили експресије MYH и распон типова влакана разликују од оних код људи.2 Ситуацију додатно компликује чињеница да различити људски скелетни мишићи показују широк распон типова влакана.7 Вастус lateralis је мешовити мишић са средњим (и стога репрезентативним) профилом експресије MYH.7 Штавише, лакоћа узорковања га чини најбоље проученим мишићем код људи.
Стога је непристрасно истраживање разноликости влакана скелетних мишића коришћењем моћних „омикс“ алата критично, али и изазовно, делимично због вишејезгарне природе влакана скелетних мишића. Међутим, технологије транскриптомике8,9 и протеомике10 су последњих година доживеле револуцију у осетљивости захваљујући различитим технолошким достигнућима, омогућавајући анализу скелетних мишића са резолуцијом појединачних влакана. Као резултат тога, постигнут је значајан напредак у карактеризацији разноликости појединачних влакана и њиховом одговору на атрофичне стимулусе и старење11,12,13,14,15,16,17,18. Важно је напоменути да ови технолошки напредак има клиничке примене, омогућавајући детаљнију и прецизнију карактеризацију дисрегулације повезане са болестима. На пример, патофизиологија немалинске миопатије, једне од најчешћих наследних болести мишића (MIM 605355 и MIM 161800), је сложена и збуњујућа.19,20 Стога, боља карактеризација дисрегулације влакана скелетних мишића могла би довести до значајног напретка у нашем разумевању ове болести.
Развили смо методе за транскриптомску и протеомску анализу појединачних влакана скелетних мишића ручно изолованих из узорака људске биопсије и применили их на хиљаде влакана, што нам је омогућило да истражимо ћелијску хетерогеност влакана скелетних мишића човека. У току овог рада, демонстрирали смо моћ транскриптомског и протеомског фенотипизације мишићних влакана и идентификовали метаболичке, рибозомске и ћелијске спојне протеине као значајне изворе варијабилности између влакана. Штавише, користећи овај протеомски ток рада, окарактерисали смо клинички значај миопатије нематода у појединачним влакнима скелетних мишића, откривајући координисано померање ка неоксидативним влакнима независно од типа влакана на основу MYH.
Да бисмо истражили хетерогеност влакана скелетних мишића код људи, развили смо два тока рада како бисмо омогућили анализу транскриптома и протеома појединачних влакана скелетних мишића (слика 1А и додатна слика 1А). Развили смо и оптимизовали неколико методолошких корака, од складиштења узорака и очувања интегритета РНК и протеина до оптимизације пропусног опсега за сваки приступ. За анализу транскриптома, ово је постигнуто уметањем молекуларних баркодова специфичних за узорак у почетном кораку реверзне транскрипције, омогућавајући обједињавање 96 влакана за ефикасну даљу обраду. Дубље секвенцирање (±1 милион очитавања по влакну) у поређењу са традиционалним приступима појединачних ћелија додатно је обогатило податке о транскриптому.21 За протеомику, користили смо кратки хроматографски градијент (21 минут) у комбинацији са DIA-PASEF аквизицијом података на timsTOF масеном спектрометру како бисмо оптимизовали дубину протеома уз одржавање високог пропусног опсега. 22,23 Да бисмо истражили хетерогеност здравих влакана скелетних мишића, окарактерисали смо транскриптоме 1.050 појединачних влакана од 14 здравих одраслих донора и протеоме 1.038 влакана од 5 здравих одраслих донора (Додатна табела 1). У овом раду, ови скупови података се називају транскриптоми и протеоми са 1.000 влакана, респективно. Наш приступ је детектовао укупно 27.237 транскрипата и 2.983 протеина у транскриптомским и протеомским анализама са 1.000 влакана (Слика 1А, Допунски скупови података 1–2). Након филтрирања транскриптомских и протеомских скупова података за >1.000 детектованих гена и 50% валидних вредности по влакну, накнадне биоинформатичке анализе су извршене за 925 и 974 влакана у транскриптому и протеому, респективно. Након филтрирања, просечно 4257 ± 1557 гена и 2015 ± 234 протеина (средња вредност ± стандардна девијација) је детектовано по влакну, са ограниченом интериндивидуалном варијабилношћу (Додатне слике 1Б–Ц, Допунски скупови података 3–4). Међутим, варијабилност унутар субјекта била је израженија код учесника, вероватно због разлика у приносу РНК/протеина између влакана различитих дужина и површина попречног пресека. За већину протеина (>2000), коефицијент варијације је био испод 20% (Допунска слика 1Д). Обе методе су омогућиле снимање широког динамичког опсега транскрипата и протеина са високо израженим потписима важним за контракцију мишића (нпр. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Допунске слике 1Е–Ф). Већина идентификованих карактеристика била је заједничка између транскриптомских и протеомских скупова података (Допунска слика 1Г), а средњи интензитети UMI/LFQ ових карактеристика били су релативно добро корелирани (r = 0,52) (Допунска слика 1Х).
Радни ток за транскриптомику и протеомику (креиран помоћу BioRender.com). BD Криве динамичког опсега за MYH7, MYH2 и MYH1, и израчунати прагови за додељивање типа влакана. E, F Дистрибуција експресије MYH кроз влакна у скуповима података за транскриптомику и протеомику. G, H Графикони униформне апроксимације и пројекције разноликости (UMAP) за транскриптомику и протеомику обојени типом влакана заснованим на MYH. I, J Карактеристични дијаграми који приказују експресију MYH7, MYH2 и MYH1 у скуповима података за транскриптомику и протеомику.
Првобитно смо кренули да доделимо тип влакана заснован на MYH-у сваком влакну користећи оптимизован приступ који користи високу осетљивост и динамички опсег експресије MYH у омик скуповима података. Претходне студије су користиле произвољне прагове за означавање влакана као чисти тип 1, тип 2A, тип 2X или мешани на основу фиксног процента експресије различитих MYH-ова11,14,24. Користили смо другачији приступ у којем је експресија сваког влакна рангирана према MYH-овима које смо користили за типизацију влакана: MYH7, MYH2 и MYH1, што одговара влакнима типа 1, типа 2A и типа 2X, респективно. Затим смо математички израчунали доњу тачку инфлексије сваке резултујуће криве и користили је као праг за додељивање влакана као позитивних (изнад прага) или негативних (испод прага) за сваки MYH (слика 1B–D). Ови подаци показују да MYH7 (слика 1B) и MYH2 (слика 1C) имају изразитије профиле експресије „on/off“ на нивоу РНК у поређењу са нивоом протеина. Заиста, на нивоу протеина, врло мало влакана није експресовало MYH7, а ниједно влакно није имало 100% експресију MYH2. Затим смо користили унапред одређене прагове експресије да бисмо свим влакнима у сваком скупу података доделили типове влакана засноване на MYH. На пример, влакна MYH7+/MYH2-/MYH1- су додељена типу 1, док су влакна MYH7-/MYH2+/MYH1+ додељена мешовитом типу 2A/2X (видети Додатну табелу 2 за потпуни опис). Обједињујући сва влакна, приметили смо изузетно сличну дистрибуцију типова влакана заснованих на MYH и на нивоу РНК (слика 1E) и протеина (слика 1F), док се релативни састав типова влакана заснованих на MYH разликовао међу појединцима, као што се и очекивало (Додатна слика 2A). Већина влакана је класификована или као чисти тип 1 (34–35%) или тип 2A (36–38%), иако је откривен и значајан број мешовитих влакана типа 2A/2X (16–19%). Упечатљива разлика је у томе што се чиста влакна типа 2X могу детектовати само на нивоу РНК, али не и на нивоу протеина, што сугерише да је брза експресија MYH барем делимично регулисана пост-транскрипционо.
Валидирали смо нашу методу типизације MYH влакана засновану на протеомици користећи дот блотинг на бази антитела, и обе методе су постигле 100% сагласност у идентификацији чистих влакана типа 1 и типа 2А (видети Додатну слику 2Б). Међутим, приступ заснован на протеомици био је осетљивији, ефикаснији у идентификацији мешовитих влакана и квантификацији удела сваког MYH гена у сваком влакну. Ови подаци показују ефикасност коришћења објективног, високо осетљивог приступа заснованог на омици за карактеризацију типова влакана скелетних мишића.
Затим смо користили комбиноване информације које су пружиле транскриптомика и протеомика да бисмо објективно класификовали миофибрала на основу њиховог комплетног транскриптома или протеома. Користећи метод униформне многоструке апроксимације и пројекције (UMAP) за смањење димензионалности на шест главних компоненти (Допунске слике 3A–B), успели смо да визуализујемо варијабилност миофибрала у транскриптому (Слика 1G) и протеому (Слика 1H). Приметно је да миофибрала нису груписана по учесницима (Допунске слике 3C–D) или данима тестирања (Допунска слика 3E) ни у транскриптомским ни у протеомским скуповима података, што сугерише да је варијабилност унутар субјекта у скелетним мишићним влакнима већа него варијабилност између субјеката. На UMAP графикону појавила су се два различита кластера која представљају „брза“ и „спора“ миофибрала (Слике 1G–H). MYH7+ (спора) миофибрила су била груписана на позитивном полу UMAP1, док су MYH2+ и MYH1+ (брза) миофибрила била груписана на негативном полу UMAP1 (Слике 1I–J). Међутим, није направљена разлика између типова влакана са брзим контракцијама (тј. тип 2A, тип 2X или мешовита 2A/2X) на основу експресије MYH, што сугерише да експресија MYH1 (Слика 1I–J) или других класичних 2X миофибриларних маркера као што су ACTN3 или MYLK2 (Допунске слике 4A–B) не прави разлику између различитих типова миофибрилака када се разматра цео транскриптом или протеом. Штавише, у поређењу са MYH2 и MYH7, мало транскрипата или протеина је било позитивно корелирано са MYH1 (Допунске слике 4C–H), што сугерише да обиље MYH1 не одражава у потпуности транскриптом/протеом миофибрилака. Слични закључци су донети приликом процене мешовите експресије три MYH изоформе на UMAP нивоу (Допунске слике 4I–J). Дакле, док се 2X влакна могу идентификовати на нивоу транскрипта само на основу квантификације MYH, MYH1+ влакна се не разликују од других брзих влакана када се разматра цео транскриптом или протеом.
Као почетно истраживање хетерогености спорих влакана изван MYH, проценили смо четири утврђена протеина специфична за тип спорих влакана: TPM3, TNNT1, MYL3 и ATP2A22. Подтипови спорих влакана показали су високе, иако не савршене, Пирсонове корелације са MYH7 и у транскриптомици (додатна слика 5А) и у протеомици (додатна слика 5Б). Приближно 25% и 33% спорих влакана није класификовано као чиста спора влакна од стране свих подтипова гена/протеина у транскриптомици (додатна слика 5Ц) и протеомици (додатна слика 5Д), респективно. Стога, класификација спорих влакана заснована на вишеструким подтиповима гена/протеина уводи додатну сложеност, чак и за протеине за које се зна да су специфични за тип влакана. Ово сугерише да класификација влакана заснована на изоформама једне породице гена/протеина можда не одражава адекватно праву хетерогеност влакана скелетних мишића.
Да бисмо даље истражили фенотипску варијабилност влакана скелетних мишића човека на скали целог омик модела, извршили смо непристрасну редукцију димензионалности података користећи анализу главних компоненти (PCA) (Слика 2А). Слично UMAP графиконима, ни учесник ни дан тестирања нису утицали на груписање влакана на PCA нивоу (Допунске слике 6А–Ц). У оба скупа података, тип влакана заснован на MYH објашњен је помоћу PC2, који је показао кластер споро контрахујућих влакана типа 1 и други кластер који садржи брзо контрахујућа влакна типа 2А, типа 2X и мешовита 2A/2X влакна (Слика 2А). У оба скупа података, ова два кластера су била повезана малим бројем мешовитих влакана типа 1/2А. Као што се и очекивало, анализа прекомерне заступљености главних PC покретача потврдила је да је PC2 покретан контрактилним и метаболичким потписима (Слика 2Б и Допунске слике 6Д–Е, Допунски скупови података 5–6). Генерално, утврђено је да је тип влакана базиран на MYH довољан да објасни континуирану варијацију дуж PC2, са изузетком такозваних 2X влакана која су распоређена по целом транскриптому унутар брзог кластера.
А. Графикони анализе главних компоненти (PCA) скупова података транскриптома и протеома обојени према типу влакана на основу MYH. Б. Анализа обогаћивања транскриптних и протеинских драјвера у PC2 и PC1. Статистичка анализа је извршена коришћењем пакета clusterProfiler и p-вредности прилагођених Бенџамини-Хохбергом. C, D. PCA графикони обојени према терминима онтологије гена (GO) међућелијске адхезије у транскриптому и GO терминима костамере у протеому. Стрелице представљају транскриптне и протеинске драјвере и њихове правце. E, F. Графикони униформне многоструке апроксимације и пројекције (UMAP) карактеришу клинички релевантне карактеристике које приказују градијенте експресије независно од типа спорих/брзих влакана. G, H. Корелације између PC2 и PC1 драјвера у транскриптомима и протеомима.
Неочекивано, тип миофибрила заснован на MYH објашњава само други највећи степен варијабилности (PC2), што сугерише да други биолошки фактори који нису повезани са типом миофибрила заснованим на MYH (PC1) играју важну улогу у регулисању хетерогености влакана скелетних мишића. Анализа прекомерне заступљености главних покретача у PC1 открила је да је варијабилност у PC1 првенствено одређена ћелијско-ћелијском адхезијом и садржајем рибозома у транскриптому, и костамерима и рибозомским протеинима у протеому (слика 2Б и додатне слике 6D–E, додатни скуп података 7). У скелетним мишићима, костамере повезују Z-диск са сарколемом и укључене су у пренос силе и сигнализацију. 25 Анотирани PCA графикони коришћењем карактеристика ћелијско-ћелијске адхезије (транскриптом, слика 2C) и костамере (протеом, слика 2D) открили су снажан помак улево у PC1, што указује да су ове карактеристике обогаћене одређеним влакнима.
Детаљнијим испитивањем груписања миофибракана на UMAP нивоу откривено је да већина карактеристика показује градијент експресије заснован на MYH-у независан од типа миофибракана, а не специфичан за подгрупе миофибракана. Овај континуитет је примећен код неколико гена повезаних са патолошким стањима (Слика 2Е), као што су CHCHD10 (неуромускуларна болест), SLIT3 (атрофија мишића), CTDNEP1 (болест мишића). Овај континуитет је такође примећен у целом протеому, укључујући протеине повезане са неуролошким поремећајима (UGDH), инсулинском сигнализацијом (PHIP) и транскрипцијом (HIST1H2AB) (Слика 2Ф). Заједно, ови подаци указују на континуитет у хетерогености спорог/брзог трзања независној од типа влакана код различитих миофибракана.
Занимљиво је да су гени управљачки у PC2 показали добру корелацију транскриптома и протеома (r = 0,663) (Слика 2G), што сугерише да су типови влакана са спорим и брзим контракцијама, а посебно контрактилна и метаболичка својства влакана скелетних мишића, транскрипционо регулисани. Међутим, гени управљачки у PC1 нису показали корелацију транскриптома и протеома (r = -0,027) (Слика 2H), што сугерише да су варијације које нису повезане са типовима влакана са спорим/брзим контракцијама углавном регулисане посттранскрипционо. Пошто су варијације у PC1 првенствено објашњене терминима онтологије рибозомских гена, и с обзиром на то да рибозоми играју кључну и специјализовану улогу у ћелији активним учешћем и утицајем на транслацију протеина,31 затим смо кренули да истражимо ову неочекивану хетерогеност рибозома.
Прво смо обојили дијаграм анализе главних компоненти протеомике према релативном обиљу протеина у GOCC термину „цитоплазматски рибозом“ (слика 3А). Иако је овај термин обогаћен на позитивној страни PC1, што резултира малим градијентом, рибозомални протеини покрећу партиционисање у оба смера PC1 (слика 3А). Рибозомални протеини обогаћени на негативној страни PC1 укључивали су RPL18, RPS18 и RPS13 (слика 3Б), док су RPL31, RPL35 и RPL38 (слика 3Ц) били главни покретачи на позитивној страни PC1. Занимљиво је да су RPL38 и RPS13 били високо експресовани у скелетним мишићима у поређењу са другим ткивима (додатна слика 7А). Ови препознатљиви рибозомални потписи у PC1 нису примећени у транскриптому (додатна слика 7Б), што указује на посттранскрипциону регулацију.
А. График анализе главних компоненти (PCA) обојен према терминима цитоплазматске рибозомалне генске онтологије (GO) преко протеома. Стрелице означавају смер варијација посредованих протеинима на PCA графикону. Дужина линије одговара резултату главне компоненте за дати протеин. Б, Ц. PCA карактеристични дијаграми за RPS13 и RPL38. Д. Ненадзирана хијерархијска анализа кластеровања цитоплазматских рибозомалних протеина. Е. Структурни модел 80S рибозома (PDB: 4V6X) који истиче рибозомалне протеине са различитим обиљем у влакнима скелетних мишића. Ф. Рибозомални протеини са различитом стехиометријом локализовани близу излазног канала иРНК.
Концепти хетерогености и специјализације рибозома су претходно предложени, где присуство различитих субпопулација рибозома (хетерогеност рибозома) може директно утицати на транслацију протеина у различитим ткивима32 и ћелијама33 путем селективне транслације специфичних базена транскрипта мРНК34 (специјализација рибозома). Да бисмо идентификовали субпопулације рибозомских протеина који се коекспресују у влакнима скелетних мишића, извршили смо ненадзирану хијерархијску анализу кластеровања рибозомских протеина у протеому (Слика 3Д, Додатни скуп података 8). Као што се и очекивало, рибозомски протеини се нису груписали по типу влакана на основу MYH. Међутим, идентификовали смо три различита кластера рибозомских протеина; први кластер (рибозомски_кластер_1) је корегулисан са RPL38 и стога има повећану експресију у влакнима са позитивним PC1 профилом. Други кластер (рибозомски_кластер_2) је корегулисан са RPS13 и повишен је у влакнима са негативним PC1 профилом. Трећи кластер (рибозомски_кластер_3) не показује координисану диференцијалну експресију у влакнима скелетних мишића и може се сматрати „језгром“ рибозомског протеина скелетних мишића. И рибозомални кластери 1 и 2 садрже рибозомалне протеине за које је претходно показано да регулишу алтернативну транслацију (нпр. RPL10A, RPL38, RPS19 и RPS25) и функционално утичу на развој (нпр. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 У складу са резултатима PCA, примећена хетерогена репрезентација ових рибозомалних протеина кроз влакна такође је показала континуитет (Допунска слика 7C).
Да бисмо визуализовали локацију хетерогених рибозомских протеина унутар рибозома, користили смо структурни модел људског 80S рибозома (Protein Data Bank: 4V6X) (Слика 3Е). Након изоловања рибозомских протеина који припадају различитим рибозомским кластерима, њихове локације нису биле уско поравнате, што сугерише да наш приступ није успео да обезбеди обогаћивање одређених региона/фракција рибозома. Занимљиво је, међутим, да је удео протеина великих подјединица у кластеру 2 био нижи него у кластерима 1 и 3 (Допунска слика 7Д). Приметили смо да су протеини са измењеном стехиометријом у влакнима скелетних мишића претежно локализовани на површини рибозома (Слика 3Е), што је у складу са њиховом способношћу да интерагују са елементима унутрашњег места уласка рибозома (IRES) у различитим популацијама иРНК, чиме координишу селективну транслацију. 40, 41 Штавише, многи протеини са измењеном стехиометријом у влакнима скелетних мишића налазили су се у близини функционалних региона као што је излазни тунел иРНК (Слика 3Ф), који селективно регулишу транслационо издужење и заустављање специфичних пептида. 42 Укратко, наши подаци указују на то да стехиометрија рибозомских протеина скелетних мишића показује хетерогеност, што резултира разликама између влакана скелетних мишића.
Затим смо кренули у идентификацију потписа брзог и спорог трзања влакана и истраживање механизама њихове транскрипционе регулације. Упоређујући кластере брзог и спорог трзања влакана дефинисане помоћу UMAP-а у два скупа података (слике 1G–H и 4A–B), транскриптомске и протеомске анализе су идентификовале 1366 и 804 различито заступљене карактеристике, респективно (слике 4A–B, додатни скупови података 9–12). Уочили смо очекиване разлике у потписима везаним за саркомере (нпр. тропомиозин и тропонин), спрезање ексцитације и контракције (SERCA изоформе) и енергетски метаболизам (нпр. ALDOA и CKB). Штавише, транскрипти и протеини који регулишу убиквитинацију протеина били су различито експресовани у брзом и спором трзајућем влакну (нпр. USP54, SH3RF2, USP28 и USP48) (слике 4A–B). Штавише, ген микробног протеина RP11-451G4.2 (DWORF), за који је претходно показано да се диференцијално експресује у различитим типовима мишићних влакана јагњетине43 и појачава активност SERCA у срчаном мишићу44, био је значајно појачан у спорим скелетним мишићним влакнима (Слика 4А). Слично томе, на нивоу појединачних влакана, примећене су значајне разлике у познатим потписима као што су изоформе лактат дехидрогеназе повезане са метаболизмом (LDHA и LDHB, Слика 4C и Додатна слика 8A)45,46, као и раније непознати потписи специфични за тип влакана (као што су IRX3, USP54, USP28 и DPYSL3) (Слика 4C). Дошло је до значајног преклапања диференцијално експресованих карактеристика између транскриптомских и протеомских скупова података (Додатна слика 8B), као и корелација промене прегиба вођена углавном израженијом диференцијалном експресијом карактеристика саркомера (Додатна слика 8C). Приметно је да су неки потписи (нпр. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) показали јаку пост-транскрипциону регулацију само на протеомском нивоу и имали су специфичне профиле експресије за тип спорих/брзих влакана (додатна слика 8C).
А и Б вулкански дијаграми који упоређују споре и брзе кластере идентификоване помоћу дијаграма униформне многоструке апроксимације и пројекције (UMAP) на сликама 1G–H. Обојене тачке представљају транскрипте или протеине који се значајно разликују при FDR < 0,05, а тамније тачке представљају транскрипте или протеине који се значајно разликују при логаритамској промени > 1. Двосмерна статистичка анализа је извршена коришћењем DESeq2 Валд теста са Бенџамини-Хохбергово прилагођеним p-вредностима (транскриптомика) или методом линеарног модела Лима са емпиријском Бајесовом анализом праћеном Бенџамини-Хохберговим прилагођавањем за вишеструка поређења (протеомика). Ц Диаграми потписа одабраних диференцијално експримираних гена или протеина између спорих и брзих влакана. Д Анализа обогаћивања значајно диференцијално експримираних транскрипата и протеина. Преклапајуће вредности су обогаћене у оба скупа података, вредности транскриптома су обогаћене само у транскриптому, а вредности протеома су обогаћене само у протеому. Статистичка анализа је извршена коришћењем пакета clusterProfiler са Бенџамини-Хохбергово прилагођеним p-вредностима. Е. Транскрипциони фактори специфични за тип влакана идентификовани помоћу SCENIC-а на основу SCENIC-ових резултата специфичности регулатора и диференцијалне експресије мРНК између типова влакана. Ф. Профилисање одабраних транскрипционих фактора диференцијално експресованих између спорих и брзих влакана.
Затим смо извршили анализу прекомерне заступљености диференцијално заступљених гена и протеина (слика 4Д, додатни скуп података 13). Обогаћивање путање за карактеристике које су се разликовале између два скупа података открило је очекиване разлике, као што су процеси β-оксидације масних киселина и метаболизма кетона (спора влакна), контракција миофиламента/мишића (брза и спора влакна, респективно) и катаболички процеси угљених хидрата (брза влакна). Активност серин/треонин протеин фосфатазе је такође била повишена у брзим влакнима, вођена карактеристикама као што су регулаторне и каталитичке подјединице фосфатазе (PPP3CB, PPP1R3D и PPP1R3A), за које је познато да регулишу метаболизам гликогена (47) (додатне слике 8Д–Е). Други путеви обогаћени брзим влакнима укључивали су тела за обраду (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) у протеому (додатна слика 8F), потенцијално укључена у пост-транскрипциону регулацију (48), и активност транскрипционих фактора (SREBF1, RXRG, RORA) у транскриптому (додатна слика 8G). Спора влакна су била обогаћена активношћу оксидоредуктазе (BDH1, DCXR, TXN2) (додатна слика 8H), везивањем амида (CPTP, PFDN2, CRYAB) (додатна слика 8I), екстрацелуларним матриксом (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (додатна слика 8J) и активношћу рецептор-лиганда (FNDC5, SPX, NENF) (додатна слика 8K).
Да бисмо стекли дубљи увид у транскрипциону регулацију која лежи у основи карактеристика спорих/брзих типова мишићних влакана, извршили смо анализу обогаћивања транскрипционих фактора користећи SCENIC49 (Додатни скуп података 14). Многи транскрипциони фактори су значајно обогаћени између брзих и спорих мишићних влакана (Слика 4Е). То је укључивало транскрипционе факторе као што је MAFA, који је раније био повезан са развојем брзих мишићних влакана,50 као и неколико транскрипционих фактора који раније нису били повезани са генским програмима специфичним за тип мишићних влакана. Међу њима, PITX1, EGR1 и MYF6 били су најобогаћенији транскрипциони фактори у брзим мишићним влакнима (Слика 4Е). Насупрот томе, ZSCAN30 и EPAS1 (такође познат као HIF2A) били су најобогаћенији транскрипциони фактори у спорим мишићним влакнима (Слика 4Е). У складу са тим, MAFA је био експресован на вишим нивоима у UMAP региону који одговара брзим мишићним влакнима, док је EPAS1 имао супротан образац експресије (Слика 4F).
Поред познатих гена који кодирају протеине, постоје бројни биотипови некодирајућих РНК који могу бити укључени у регулацију људског развоја и болести. 51, 52 У скуповима података транскриптома, неколико некодирајућих РНК показују специфичност типа влакана (слика 5А и додатни скуп података 15), укључујући LINC01405, која је веома специфична за спора влакна и за коју се наводи да је смањена у мишићима код пацијената са митохондријалном миопатијом. 53 Насупрот томе, RP11-255P5.3, који одговара гену lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, показује специфичност типа брзог влакана. И LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) и RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) показују специфичност за скелетне мишиће (додатне слике 9A–B) и немају познате контрактилне гене унутар свог геномског окружења од 1 Mb, што сугерише да играју специјализовану улогу у регулисању типова влакана, а не у регулисању суседних контрактилних гена. Профили експресије специфични за споре/брзе типове влакана LINC01405 и RP11-255P5.3, респективно, потврђени су коришћењем RNAscope-а (слике 5B–C).
А. Транскрипти некодирајуће РНК су значајно регулисани у спорим и брзим мишићним влакнима. Б. Репрезентативне слике РНКскопа које приказују специфичност типа спорих и брзих влакана LINC01405 и RP11-255P5.3, респективно. Скала = 50 μм. Ц. Квантификација експресије некодирајуће РНК специфичне за тип миофибракана одређене РНКскопом (n = 3 биопсије од независних појединаца, упоређујући брза и спора мишићна влакна унутар сваке јединке). Статистичка анализа је извршена коришћењем двостраног Студентовог t-теста. Кутијасти дијаграми приказују медијану и први и трећи квартил, са брковима који указују на минималне и максималне вредности. Д. Де ново ток рада за идентификацију микробних протеина (креиран помоћу BioRender.com). Е. Микробни протеин LINC01405_ORF408:17441:17358 је специфично експресован у спорим скелетним мишићним влакнима (n = 5 биопсија од независних учесника, упоређујући брза и спора мишићна влакна код сваког учесника). Статистичка анализа је спроведена коришћењем Лимове методе линеарног модела у комбинацији са емпиријским Бајесовим приступом, а затим Бенџамини-Хохберговом методом за вишеструка поређења са прилагођавањем p-вредности. Кутијасти дијаграми приказују медијану, први и трећи квартил, са брковима који указују на максималне/минималне вредности.
Недавне студије су показале да многи претпостављени некодирајући транскрипти кодирају транскрибоване микробне протеине, од којих неки регулишу функцију мишића. 44, 55 Да бисмо идентификовали микробне протеине са потенцијалном специфичношћу за тип влакана, претражили смо наш скуп података од 1000 влакана протеома користећи прилагођену FASTA датотеку која садржи секвенце некодирајућих транскрипата (n = 305) пронађених у скупу података од 1000 влакана транскриптома (слика 5D). Идентификовали смо 197 микробних протеина из 22 различита транскрипта, од којих је 71 диференцијално регулисан између спорих и брзих скелетних мишићних влакана (додатна слика 9C и додатни скуп података 16). За LINC01405, идентификована су три производа микробних протеина, од којих је један показао сличну специфичност за спора влакна као и његов транскрипт (слика 5E и додатна слика 9D). Стога смо идентификовали LINC01405 као ген који кодира микробни протеин специфичан за спора скелетна мишићна влакна.
Развили смо свеобухватни ток рада за протеомску карактеризацију појединачних мишићних влакана великих размера и идентификовали регулаторе хетерогености влакана у здравим стањима. Применили смо овај ток рада да бисмо разумели како немалинске миопатије утичу на хетерогеност влакана скелетних мишића. Немалинске миопатије су наследне болести мишића које узрокују слабост мишића и, код оболеле деце, јављају се са низом компликација, укључујући респираторни дистрес, сколиозу и ограничену покретљивост удова. 19,20 Типично, код немалинских миопатија, патогене варијанте у генима као што је актин алфа 1 (ACTA1) доводе до превласти састава миофибракана са спорим контракцијама, иако је овај ефекат хетероген. Један значајан изузетак је тропонин Т1 немалинска миопатија (TNNT1), која има превласт брзих влакана. Стога, боље разумевање хетерогености која лежи у основи дисрегулације влакана скелетних мишића примећене код немалинских миопатија може помоћи у откривању сложеног односа између ових болести и типа миофибракана.
У поређењу са здравим контролама (н=3 по групи), миофибрила изолована од пацијената са немалинском миопатијом са мутацијама у генима ACTA1 и TNNT1 показала су изражену атрофију или дистрофију миофибрила (слика 6А, додатна табела 3). Ово је представљало значајне техничке изазове за протеомску анализу због ограничене количине доступног материјала. Упркос томе, успели смо да детектујемо 2485 протеина у 272 скелетна миофибрила. Након филтрирања за најмање 1000 квантификованих протеина по влакну, 250 влакана је подвргнуто накнадној биоинформатичкој анализи. Након филтрирања, квантификовано је у просеку 1573 ± 359 протеина по влакну (додатна слика 10А, додатни скупови података 17–18). Приметно је да је, упркос значајном смањењу величине влакана, дубина протеома узорака пацијената са немалинском миопатијом само незнатно смањена. Штавише, обрада ових података коришћењем наших сопствених FASTA датотека (укључујући некодирајуће транскрипте) омогућила нам је да идентификујемо пет микробних протеина у скелетним миофибрима пацијената са немалинском миопатијом (Додатни скуп података 19). Динамички опсег протеома био је значајно шири, а укупни протеини у контролној групи добро су се поклапали са резултатима претходне анализе протеома са 1000 влакана (Додатна слика 10Б–Ц).
А. Микроскопске слике које приказују атрофију или дистрофију влакана и превласт различитих типова влакана на основу MYH код ACTA1 и TNNT1 немалински миопатија (NM). Скала = 100 μm. Да би се осигурала репродуктивност бојења код ACTA1 и TNNT1 пацијената, три биопсије пацијената су обојене два до три пута (четири пресека по случају) пре одабира репрезентативних слика. Б. Пропорције типова влакана код учесника на основу MYH. Ц. График анализе главних компоненти (PCA) скелетних мишићних влакана код пацијената са немалински миопатијама и контролне групе. Д. Скелетна мишићна влакна пацијената са немалински миопатијама и контролне групе пројектована на PCA графикон одређен на основу 1000 анализираних влакана на слици 2. На пример, вулкански графикони који упоређују разлике између учесника са ACTA1 и TNNT1 немалински миопатијама и контролне групе, и између учесника са ACTA1 и TNNT1 немалински миопатијама. Обојени кругови означавају протеине који су се значајно разликовали при π < 0,05, а тамне тачке означавају протеине који су се значајно разликовали при FDR < 0,05. Статистичка анализа је спроведена коришћењем методе линеарног модела Лима и емпиријских Бајесових метода, након чега је извршено прилагођавање p-вредности за вишеструка поређења коришћењем Бенџамини-Хохбергове методе. H. Анализа обогаћивања значајно диференцијално експримираних протеина у целом протеому и у влакнима типа 1 и 2А. Статистичка анализа је спроведена коришћењем пакета clusterProfiler и Бенџамини-Хохбергом прилагођених p-вредности. I, J. Графикони анализе главних компоненти (PCA) обојени терминима екстрацелуларног матрикса и митохондријалне генске онтологије (GO).
Пошто немалинске миопатије могу утицати на удео типова миофибрака који експресују MYH у скелетним мишићима,19,20 прво смо испитали типове миофибрака који експресују MYH код пацијената са немалински миопатијама и контролне групе. Одредили смо тип миофибрака користећи непристрасну методу која је претходно описана за тест са 1000 миофибрака (Допунске слике 10D–E) и поново нисмо успели да идентификујемо чисте 2X миофибра (Слика 6B). Уочили смо хетерогени ефекат немалинских миопатија на тип миофибрака, јер су два пацијента са ACTA1 мутацијама имала повећан удео миофибрака типа 1, док су два пацијента са TNNT1 немалинском миопатијом имала смањен удео миофибрака типа 1 (Слика 6B). Заиста, експресија MYH2 и брзих изоформи тропонина (TNNC2, TNNI2 и TNNT3) била је смањена код ACTA1-немалинских миопатија, док је експресија MYH7 била смањена код TNNT1-немалинских миопатија (Допунска слика 11А). Ово је у складу са претходним извештајима о хетерогеној промени типа миофибрака код немалинских миопатија.19,20 Потврдили смо ове резултате имунохистохемијом и открили да пацијенти са ACTA1-немалинском миопатијом имају претежно присуство миофибрака типа 1, док су пацијенти са TNNT1-немалинском миопатијом имали супротан образац (Слика 6А).
На нивоу протеома једног влакна, влакна скелетних мишића пацијената са ACTA1 и TNNT1 немалинском миопатијом груписала су се са већином контролних влакана, при чему су влакна TNNT1 немалинске миопатије генерално била најтеже погођена (Слика 6C). Ово је било посебно очигледно приликом цртања графикона анализе главних компоненти (PCA) псеудо-надувених влакана за сваког пацијента, при чему су пацијенти 2 и 3 са TNNT1 немалинском миопатијом изгледали најудаљеније од контролних узорака (Допунска слика 11B, Додатни скуп података 20). Да бисмо боље разумели како се влакна пацијената са миопатијом упоређују са здравим влакнима, користили смо детаљне информације добијене протеомском анализом 1.000 влакана од здравих одраслих учесника. Пројектовали смо влакна из скупа података о миопатији (пацијенти и контролна група са ACTA1 и TNNT1 немалинском миопатијом) на PCA графикон добијен протеомском анализом 1000 влакана (Слика 6D). Дистрибуција типова MYH влакана дуж PC2 у контролним влакнима била је слична дистрибуцији влакана добијеној протеомском анализом 1000 влакана. Међутим, већина влакана код пацијената са немалинском миопатијом померила се низ PC2, преклапајући се са здравим брзоконтрахујућим влакнима, без обзира на њихов природни MYH тип влакана. Дакле, иако су пацијенти са ACTA1 немалинском миопатијом показали померање ка влакнима типа 1 када су квантификовани коришћењем MYH-заснованих метода, и ACTA1 немалинска миопатија и TNNT1 немалинска миопатија помериле су протеом скелетних мишићних влакана ка брзоконтрахујућим влакнима.
Затим смо директно упоредили сваку групу пацијената са здравим контролама и идентификовали 256 и 552 диференцијално експресована протеина код ACTA1 и TNNT1 немалински миопатија, респективно (слика 6E–G и додатна слика 11C, додатни скуп података 21). Анализа обогаћивања гена открила је координисано смањење митохондријалних протеина (слика 6H–I, додатни скуп података 22). Изненађујуће, упркос диференцијалној превласти типова влакана код ACTA1 и TNNT1 немалински миопатија, ово смањење је било потпуно независно од типа влакана заснованог на MYH (слика 6H и додатне слике 11D–I, додатни скуп података 23). Три микробна протеина су такође била регулисана код ACTA1 или TNNT1 немалински миопатија. Два од ових микропротеина, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (такође познат као LINC00598 или Lnc-FOXO1) и ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), показали су различиту количину само у миофибрима типа 1. Раније је објављено да ENSG00000215483_TR14_ORF67 игра улогу у регулацији ћелијског циклуса. 56 С друге стране, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (који одговара LINC01798) је био повећан у миофибрима и типа 1 и типа 2А код ACTA1-немалинске миопатије у поређењу са здравим контролама (Допунска слика 12А, Додатни скуп података 24). Насупрот томе, рибозомални протеини су углавном били непогођени немалинском миопатијом, иако је RPS17 био смањен код ACTA1 немалинске миопатије (Слика 6Е).
Анализа обогаћивања је такође открила повећану регулацију процеса имуног система код ACTA1 и TNNT1 немалински миопатија, док је ћелијска адхезија такође повећана код TNNT1 немалински миопатије (Слика 6H). Обогаћивање ових екстрацелуларних фактора одразило се померањем екстрацелуларних матриксних протеина PCA у PC1 и PC2 у негативном смеру (тј. ка највише погођеним влакнима) (Слика 6J). Обе групе пацијената показале су повећану експресију екстрацелуларних протеина укључених у имуне одговоре и механизме поправке сарколеме, као што су анексини (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 и њихов интеракциони протеин S100A1159 (Додатне слике 12B–C). Раније је објављено да је овај процес појачан код мишићних дистрофија60, али, колико нам је познато, раније није био повезан са немалински миопатијама. Нормална функција овог молекуларног механизма је неопходна за поправку сарколеме након повреде и за фузију новоформираних миоцита са миофибрима58,61. Дакле, повећана активност овог процеса код обе групе пацијената указује на репаративни одговор на повреду узроковану нестабилношћу миофибрила.
Ефекти сваке немалинске миопатије били су добро корелирани (r = 0,736) и показали су разумно преклапање (додатне слике 11А–Б), што указује да ACTA1 и TNNT1 немалинска миопатија имају сличне ефекте на протеом. Међутим, неки протеини су били регулисани само код ACTA1 или TNNT1 немалинске миопатије (додатне слике 11А и Ц). Профибротични протеин MFAP4 био је један од најрегулисанијих протеина код TNNT1 немалинске миопатије, али је остао непромењен код ACTA1 немалинске миопатије. SKIC8, компонента PAF1C комплекса одговорна за регулацију транскрипције HOX гена, била је смањена код TNNT1 немалинске миопатије, али није била погођена код ACTA1 немалинске миопатије (додатна слика 11А). Директно поређење ACTA1 и TNNT1 немалинске миопатије открило је веће смањење митохондријалних протеина и повећање протеина имуног система код TNNT1 немалинске миопатије (слика 6G–H и додатне слике 11C и 11H–I). Ови подаци су у складу са већом атрофијом/дистрофијом примећеном код TNNT1 немалинске миопатије у поређењу са TNNT1 немалинском миопатијом (слика 6A), што сугерише да TNNT1 немалинска миопатија представља тежи облик болести.
Да бисмо проценили да ли примећени ефекти немалинске миопатије опстају на нивоу целог мишића, извршили смо скупну протеомску анализу мишићних биопсија из исте кохорте пацијената са TNNT1 немалинском миопатијом и упоредили их са контролама (n=3 по групи) (Допунска слика 13А, Додатни скуп података 25). Као што се и очекивало, контроле су биле уско повезане у анализи главних компоненти, док су пацијенти са TNNT1 немалинском миопатијом показали већу варијабилност међу узорцима, сличну оној која се види у анализи појединачних влакана (Допунска слика 13Б). Масовна анализа је репродуковала диференцијално експримиране протеине (Допунска слика 13Ц, Додатни скуп података 26) и биолошке процесе (Допунска слика 13Д, Додатни скуп података 27) истакнуте поређењем појединачних влакана, али је изгубила способност разликовања различитих типова влакана и није успела да узме у обзир хетерогене ефекте болести на различитим влакнима.
Узети заједно, ови подаци показују да протеомика појединачних миофибрака може да разјасни клиничке биолошке карактеристике које се не могу детектовати циљаним методама као што је имуноблотинг. Штавише, ови подаци истичу ограничења коришћења само актинске типизације влакана (MYH) за описивање фенотипске адаптације. Заиста, иако се промена типа влакана разликује код актинских и тропонинских немалинских миопатија, обе немалинске миопатије одвајају MYH типизацију влакана од метаболизма скелетних мишићних влакана ка бржем и мање оксидативном мишићном протеому.
Ћелијска хетерогеност је кључна да би ткива задовољила своје различите потребе. У скелетним мишићима, ово се често описује као типови влакана карактерисани различитим степенима производње силе и заморљивости. Међутим, јасно је да ово објашњава само мали део варијабилности влакана скелетних мишића, која је много варијабилнија, сложенија и вишеслојнија него што се раније мислило. Технолошки напредак је сада бацио светло на факторе који регулишу влакна скелетних мишића. Заиста, наши подаци сугеришу да влакна типа 2X можда нису посебан подтип влакана скелетних мишића. Штавише, идентификовали смо метаболичке протеине, рибозомске протеине и протеине повезане са ћелијама као главне детерминанте хетерогености влакана скелетних мишића. Применом нашег протеомског тока рада на узорке пацијената са миопатијом нематода, додатно смо показали да типизација влакана заснована на MYH не одражава у потпуности хетерогеност скелетних мишића, посебно када је систем поремећен. Заиста, без обзира на тип влакана заснован на MYH, миопатија нематода резултира помаком ка бржим и мање оксидативним влакнима.
Скелетна мишићна влакна су класификована од 19. века. Недавне омик анализе су нам омогућиле да почнемо да разумемо профиле експресије различитих типова MYH влакана и њихове одговоре на различите стимулусе. Као што је овде описано, омик приступи такође имају предност веће осетљивости за квантификацију маркера типа влакана него традиционалне методе засноване на антителима, без ослањања на квантификацију једног (или неколико) маркера за дефинисање типа влакана скелетних мишића. Користили смо комплементарне транскриптомске и протеомске токове рада и интегрисали резултате како бисмо испитали транскрипциону и посттранскрипциону регулацију хетерогености влакана у људским скелетним мишићним влакнима. Овај ток рада је резултирао неуспехом у идентификацији чистих влакана 2X типа на нивоу протеина у вастус латералису наше кохорте здравих младића. Ово је у складу са претходним студијама појединачних влакана које су пронашле <1% чистих 2X влакана у здравом вастус латералису, иако би ово требало потврдити у другим мишићима у будућности. Разлика између детекције скоро чистих 2X влакана на нивоу мРНК и само мешаних 2A/2X влакана на нивоу протеина је збуњујућа. Експресија иРНК изоформе MYH није циркадијална,67 што сугерише да је мало вероватно да смо „пропустили“ почетни сигнал MYH2 у наизглед чистим 2X влакнима на нивоу РНК. Једно могуће објашњење, иако чисто хипотетичко, могле би бити разлике у стабилности протеина и/или иРНК између MYH изоформи. Заиста, ниједно брзо влакно није 100% чисто ни за једну MYH изоформу, и није јасно да ли би нивои експресије иРНК MYH1 у опсегу од 70–90% резултирали једнаким обиљем MYH1 и MYH2 на нивоу протеина. Међутим, када се разматра цео транскриптом или протеом, кластер анализа може поуздано идентификовати само два различита кластера која представљају спора и брза влакна скелетних мишића, без обзира на њихов прецизан састав MYH. Ово је у складу са анализама које користе транскриптомске приступе са једним једром, које обично идентификују само два различита мионуклеарна кластера. 68, 69, 70 Штавише, иако су претходне протеомске студије идентификовале влакна типа 2X, ова влакна се не групишу одвојено од остатка брзих влакана и показују само мали број различито обилних протеина у поређењу са другим типовима влакана на основу MYH. 14 Ови резултати сугеришу да би требало да се вратимо на поглед на класификацију мишићних влакана с почетка 20. века, који је делио људска скелетна мишићна влакна не у три различите класе на основу MYH, већ у два кластера на основу њихових метаболичких и контрактилних својстава. 63
Још важније, хетерогеност миофибрила треба посматрати у вишеструким димензијама. Претходне „омичке“ студије су указивале у овом правцу, сугеришући да влакна скелетних мишића не формирају дискретне кластере већ су распоређена дуж континуума. 11, 13, 14, 64, 71 Овде показујемо да се, поред разлика у контрактилним и метаболичким својствима скелетних мишића, миофибри могу разликовати по карактеристикама везаним за ћелијско-ћелијске интеракције и механизме транслације. Заиста, пронашли смо хетерогеност рибозома у влакнима скелетних мишића која доприноси хетерогености независно од типова спорих и брзих влакана. Основни узрок ове значајне хетерогености миофибрила, независно од типа спорих и брзих влакана, остаје нејасан, али може указивати на специјализовану просторну организацију унутар мишићних фасцикула која оптимално реагује на специфичне силе и оптерећења,72 специјализовану ћелијску или орган-специфичну комуникацију са другим типовима ћелија у мишићном микроокружењу73,74,75 или разлике у активности рибозома унутар појединачних миофибрила. Заиста, показало се да је рибозомална хетероплазмија, било путем паралогне супституције RPL3 и RPL3L или на нивоу 2′O-метилације рРНК, повезана са хипертрофијом скелетних мишића76,77. Мултимичне и просторне примене у комбинацији са функционалном карактеризацијом појединачних миофибера додатно ће унапредити наше разумевање мишићне биологије на мултимичком нивоу78.
Анализирајући протеоме појединачних миофибрака код пацијената са немалинским миопатијама, такође смо показали корисност, ефикасност и применљивост протеомике појединачних миофибрака за разјашњење клиничке патофизиологије скелетних мишића. Штавише, упоређивањем нашег тока рада са глобалном протеомском анализом, успели смо да покажемо да протеомика појединачних миофибрака даје исту дубину информација као и глобална протеомика ткива и проширује ову дубину узимајући у обзир хетерогеност међу влакнима и тип миофибрака. Поред очекиваних (иако променљивих) разлика у односу типова влакана примећених код ACTA1 и TNNT1 немалинских миопатија у поређењу са здравим контролама,19 такође смо приметили оксидативно и екстрацелуларно ремоделирање независно од промене типа влакана посредоване MYH-ом. Фиброза је раније пријављена код TNNT1 немалинских миопатија.19 Међутим, наша анализа се надовезује на овај налаз откривајући и повећане нивое екстрацелуларно секретованих протеина повезаних са стресом, као што су анексини, укључени у механизме поправке сарколеме, у миофибрима пацијената са ACTA1 и TNNT1 немалински миопатијама.57,58,59 Закључно, повећани нивои анексина у миофибрима пацијената са немалинском миопатијом могу представљати ћелијски одговор за поправку тешко атрофичних миофибрила.
Иако ова студија представља највећу анализу целокупне мишићне омикe појединачних влакана код људи до сада, она није без ограничења. Изоловали смо скелетна мишићна влакна из релативно малог и хомогеног узорка учесника и једног мишића (vastus lateralis). Стога је немогуће искључити постојање специфичних популација влакана код различитих типова мишића и на екстремним границама мишићне физиологије. На пример, не можемо искључити могућност појаве подскупа ултрабрзих влакана (нпр. чиста 2X влакна) код високо тренираних спринтера и/или спортиста снаге79 или током периода мишићне неактивности66,80. Штавише, ограничена величина узорка учесника спречила нас је да истражимо полне разлике у хетерогености влакана, јер је познато да се односи типова влакана разликују код мушкараца и жена. Поред тога, нисмо били у могућности да спроведемо транскриптомске и протеомске анализе на истим мишићним влакнима или узорцима од истих учесника. Како ми и други настављамо да оптимизујемо анализе појединачних ћелија и појединачних миофибрила користећи омик анализу како бисмо постигли ултра-низак унос узорка (као што је овде показано у анализи влакана пацијената са митохондријалном миопатијом), постаје очигледна могућност комбиновања мулти-омикских (и функционалних) приступа унутар појединачних мишићних влакана.
Генерално, наши подаци идентификују и објашњавају транскрипционе и посттранскрипционе покретаче хетерогености скелетних мишића. Конкретно, представљамо податке који доводе у питање дугогодишњу догму у физиологији скелетних мишића повезану са класичном дефиницијом типова влакана заснованом на MYH. Надамо се да ћемо обновити дебату и на крају преиспитати наше разумевање класификације и хетерогености влакана скелетних мишића.
Четрнаест учесника беле расе (12 мушкараца и 2 жене) добровољно је пристало да учествује у овој студији. Студију је одобрио Етички комитет Универзитетске болнице у Генту (BC-10237), у складу је са Хелсиншком декларацијом из 2013. године и регистрована је на ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Опште карактеристике учесника приказане су у Додатној табели 1. Након добијања усменог и писменог информисаног пристанка, учесници су подвргнути лекарском прегледу пре коначног укључивања у студију. Учесници су били млади (22–42 године), здрави (без медицинских стања, без историје пушења) и умерено физички активни. Максимални унос кисеоника одређен је помоћу степ ергометра за процену физичке спремности као што је претходно описано. 81
Узорци биопсије мишића су прикупљени у мировању и на гладно три пута, у размаку од 14 дана. Пошто су ови узорци прикупљени као део веће студије, учесници су конзумирали плацебо (лактозу), антагонист Х1-рецептора (540 мг фексофенадина) или антагонист Х2-рецептора (40 мг фамотидина) 40 минута пре биопсије. Претходно смо показали да ови антагонисти хистаминских рецептора не утичу на кондицију скелетних мишића у мировању81, а није примећено груписање повезано са стањем у нашим дијаграмима контроле квалитета (додатне слике 3 и 6). Стандардизована исхрана (41,4 kcal/kg телесне тежине, 5,1 g/kg телесне тежине угљених хидрата, 1,4 g/kg телесне тежине протеина и 1,6 g/kg телесне тежине масти) је одржавана 48 сати пре сваког експерименталног дана, а стандардизовани доручак (1,5 g/kg телесне тежине угљених хидрата) је конзумиран ујутру експерименталног дана. Под локалном анестезијом (0,5 мл 1% лидокаина без адреналина), биопсије мишића су добијене из мишића вастус латералис коришћењем перкутане Бергстремове аспирације.82 Узорци мишића су одмах уграђени у RNAlater и чувани на 4°C до ручне дисекције влакана (до 3 дана).
Свеже изоловани снопови миофибрака су пребачени у свеж RNAlater медијум у посуди за култивацију. Појединачна миофибра су затим ручно дисецирана помоћу стереомикроскопа и фине пинцете. Двадесет пет влакана је дисецирано из сваке биопсије, обраћајући посебну пажњу на одабир влакана из различитих области биопсије. Након дисекције, свако влакно је нежно уроњено у 3 μl пуфера за лизу (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) који садржи протеиназу К и ензиме ДНазе како би се уклонили нежељени протеини и ДНК. Лиза ћелија и уклањање протеина/ДНК су затим започети кратким вортексирањем, центрифугирањем течности у микроцентрифуги и инкубацијом на собној температури (10 мин). Лизат је затим инкубиран у термоциклеру (T100, Bio-Rad) на 37°C током 5 мин, 75°C током 5 мин, а затим одмах чуван на -80°C до даље обраде.
Илумина-компатибилне полиаденилисане РНК библиотеке су припремљене од 2 µl лизата миофибера коришћењем QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Детаљне методе се могу наћи у упутству произвођача. Процес почиње синтезом цДНК првог ланца реверзном транскрипцијом, током које се уводе јединствени молекуларни идентификатори (UMI) и i1 баркодови специфични за узорак како би се осигурало обједињавање узорака и смањила техничка варијабилност током даље обраде. цДНК из 96 миофибера се затим обједињује и пречишћава магнетним перлицама, након чега се РНК уклања и врши синтеза другог ланца коришћењем случајних прајмера. Библиотека се пречишћава магнетним перлицама, додају се i5/i7 ознаке специфичне за пул и амплификује се PCR. Завршни корак пречишћавања производи Илумина-компатибилне библиотеке. Квалитет сваког пула библиотека је процењен коришћењем High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
На основу квантификације кубита, базени су даље обједињени у еквимоларним концентрацијама (2 nM). Добијена база је затим секвенционирана на инструменту NovaSeq 6000 у стандардном режиму коришћењем NovaSeq S2 Reagent Kit-а (1 × 100 нуклеотида) са 2 nM учитавањем (4% PhiX).
Наш цевовод је базиран на Lexogen-овом QuantSeq Pool цевоводу за анализу података (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Подаци су прво демултиплексирани помоћу bcl2fastq2 (v2.20.0) на основу i7/i5 индекса. Очитавање 2 је затим демултиплексирано помоћу idemux (v0.1.6) на основу i1 баркода узорка, а UMI секвенце су екстраховане помоћу umi_tools (v1.0.1). Очитавања су затим скраћена помоћу cutadapt (v3.4) у више рунди како би се уклонили кратки очитавања (дужине <20) или очитавања која се састоје искључиво од адаптерских секвенци. Очитавања су затим поравната са људским геномом помоћу STAR (v2.6.0c), а BAM датотеке су индексиране помоћу SAMtools (v1.11). Дуплирана очитавања су уклоњена помоћу umi_tools (v1.0.1). Коначно, бројање поравнања је извршено помоћу featureCounts у Subread (v2.0.3). Контрола квалитета је спроведена коришћењем програма FastQC (v0.11.9) у неколико међуфаза цевовода.
Сва даља биоинформатичка обрада и визуелизација извршене су у R (v4.2.3), првенствено коришћењем Seurat (v4.4.0) тока рада. 83 Стога су појединачне UMI вредности и матрице метаподатака трансформисане у Seurat објекте. Гени експримирани у мање од 30% свих влакана су уклоњени. Узорци ниског квалитета су уклоњени на основу минималног прага од 1000 UMI вредности и 1000 детектованих гена. На крају, 925 влакана је прошло све кораке филтрирања контроле квалитета. UMI вредности су нормализоване коришћењем Seurat SCTransform v2 методе, 84 укључујући свих 7418 детектованих карактеристика, а разлике између учесника су регресоване. Сви релевантни метаподаци могу се наћи у Додатном скупу података 28.
Време објаве: 10. септембар 2025.