Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену CSS подршку. За најбоље резултате, препоручујемо вам да користите новију верзију прегледача (или да онемогућите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказујемо сајт без стилизовања или JavaScript-а.
Микробни раст у ранама често се манифестује као биофилмови, који ометају зарастање и тешко их је искоренити. Нови сребрни завоји тврде да се боре против инфекција рана, али њихова ефикасност у борби против биофилма и ефекти зарастања независни од инфекције су генерално непознати. Користећи in vitro и in vivo моделе биофилма Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, извештавамо о ефикасности завоја који генеришу Ag1+ јоне; Ag1+ завоја који садрже етилендиаминтетрасирћетну киселину и бензетонијум хлорид (Ag1+/EDTA/BC), и завоја који садрже сребрно нитрат (Ag оксисоли), који производе Ag1+, Ag2+ и Ag3+ јоне за борбу против биофилма ране и његовог утицаја на зарастање. Ag1+ завоји су имали минималне ефекте на биофилм ране in vitro и код мишева (C57BL/6j). Насупрот томе, оксигенисане Ag соли и Ag1+/EDTA/BC завоји су значајно смањили број одрживих бактерија у биофилмовима in vitro и показали значајно смањење бактеријских и EPS компоненти у биофилмовима мишјих рана. Ови завоји су имали различите ефекте на зарастање рана инфицираних биофилмом и рана које нису инфициране биофилмом, при чему су завоји са оксигенисаном сољу имали повољније ефекте на реепителизацију, величину ране и упалу у поређењу са контролним третманима и другим сребрним завојима. Различита физичко-хемијска својства сребрних завоја могу имати различите ефекте на биофилм ране и зарастање, и то треба узети у обзир при избору завоја за лечење рана инфицираних биофилмом.
Хроничне ране се дефинишу као „ране које не успевају да прођу кроз нормалне фазе зарастања на уредан и благовремен начин“1. Хроничне ране стварају психолошки, социјални и економски терет за пацијенте и здравствени систем. Годишњи расходи НХС-а за лечење рана и повезаних коморбидитета процењују се на 8,3 милијарде фунти у периоду 2017–182. Хроничне ране су такође тренутно хитан проблем у Сједињеним Државама, а Медикер процењује годишње трошкове лечења пацијената са ранама на 28,1–96,8 милијарди долара3.
Инфекција је главни фактор који спречава зарастање рана. Инфекције се често манифестују као биофилмови, који су присутни у 78% хроничних рана које не зарастају. Биофилмови се формирају када се микроорганизми неповратно вежу за површине, као што су површине рана, и могу се агрегирати и формирати екстрацелуларне полимерне (EPS) заједнице. Биофилм ране је повезан са повећаним инфламаторним одговором који доводи до оштећења ткива, што може одложити или спречити зарастање4. Повећање оштећења ткива може делимично бити последица повећане активности матриксних металопротеиназа, колагеназе, еластазе и реактивних врста кисеоника5. Штавише, инфламаторне ћелије и биофилмови су сами по себи велики потрошачи кисеоника и стога могу изазвати локалну хипоксију ткива, исцрпљујући ћелије виталним кисеоником потребним за ефикасну поправку ткива6.
Зрели биофилмови су веома отпорни на антимикробне агенсе, што захтева агресивне стратегије за контролу инфекција биофилма, као што је механички третман праћен ефикасним антимикробним третманом. Пошто се биофилмови могу брзо регенерисати, ефикасни антимикробни лекови могу смањити ризик од поновног формирања након хируршког дебридмана7.
Сребро се све више користи у антимикробним завојима и често се користи као третман прве линије за хронично инфициране ране. Постоји много комерцијално доступних сребрних завоја, од којих сваки садржи различит састав, концентрацију и основну матрицу сребра. Напредак у сребрним завојима довео је до развоја нових сребрних завоја. Метални облик сребра (Ag0) је инертан; да би се постигла антимикробна ефикасност, мора изгубити електрон да би се формирало јонско сребро (Ag1+). Традиционални сребрни завоји садрже једињења сребра или метално сребро које се, када је изложено течности, разлаже и формира јоне Ag1+. Ови јони Ag1+ реагују са бактеријском ћелијом, уклањајући електроне из структурних компоненти или критичних процеса неопходних за преживљавање. Патентирана технологија довела је до развоја новог једињења сребра, Ag оксисоли (сребро нитрат, Ag7NO11), које се укључује у завоје за ране. За разлику од традиционалног сребра, разградња соли које садрже кисеоник производи стања сребра са вишом валенцом (Ag1+, Ag2+ и Ag3+). Студије ин витро су показале да су ниске концентрације оксигенисаних соли сребра ефикасније од једнојонског сребра (Ag1+) против патогених бактерија као што су Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Escherichia coli8,9. Још једна нова врста сребрног завоја укључује додатне састојке, наиме етилендиаминтетрасирћетну киселину (EDTA) и бензетонијум хлорид (BC), за које се наводи да циљају EPS биофилм и тиме повећавају продор сребра у биофилм. Ове нове технологије сребра нуде нове начине за циљање биофилмова рана. Међутим, утицај ових антимикробних средстава на окружење ране и зарастање независно од инфекције је важан како би се осигурало да не стварају неповољно окружење ране или не одлажу зарастање. Забринутост због цитотоксичности сребра ин витро је пријављена код неколико сребрних завоја10,11. Међутим, цитотоксичност ин витро се још увек није претворила у токсичност ин виво, а неколико Ag1+ завоја је показало добар безбедносни профил12.
Овде смо истраживали ефикасност карбоксиметилцелулозних облога које садрже нове формулације сребра против биофилма рана in vitro и in vivo. Поред тога, процењени су ефекти ових облога на имуни одговор и зарастање независно од инфекције.
Сви коришћени завоји били су комерцијално доступни. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Кнутсфорд, УК) је неантимикробни 100% карбоксиметилцелулозни (CMC) гел завој од влакана који је коришћен као контролни завој у овој студији. Процењена су три антимикробна CMC сребрна завоја, наиме 3M Kerracel Ag завој (3M, Кнутсфорд, УК), који садржи 1,7 тежинских процената оксигенисане соли сребра (Ag7NO11) у јонима сребра виших валената (Ag1+, Ag2+ и Ag3+). Током разградње Ag7NO11, јони Ag1+, Ag2+ и Ag3+ се формирају у односу 1:2:4. Aquacel Ag Extra облог који садржи 1,2% сребро хлорида (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Велика Британија) 13 и Aquacel Ag + Extra облог који садржи 1,2% сребро хлорида (Ag1+), EDTA и бензетонијум хлорид (ConvaTec, Deeside, Велика Британија) 14.
Сојеви коришћени у овој студији били су Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Јавно здравље Енглеске, Солсбери) и Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Јавно здравље Енглеске, Солсбери).
Бактерије су гајене преко ноћи у Милер-Хинтон бујону (Oxoid, Алтринчам, Велика Британија). Култура узгајана преко ноћи је затим разблажена 1:100 у Милер-Хинтон бујону и 200 µl је посејано на стерилне 0,2 µm Whatman циклопорне мембране (Whatman plc, Мејдстон, Велика Британија) на Милер-Хинтон агар плоче (Sigma-Aldrich Company Ltd, Кент, Велика Британија). ) Формирање колонијалног биофилма на 37°C током 24 сата. Ови колонијални биофилмови су тестирани на логаритамско скупљање.
Исеците завој на квадратне комаде од 3 цм2 и претходно навлажите стерилном дејонизованом водом. Поставите завој преко биофилма колоније на агар плочи. Сваких 24 ha биофилма је уклоњено, а одрживе бактерије унутар биофилма (CFU/ml) су квантификоване серијским разблаживањем (10−1 до 10−7) у неутрализационом бујону Day-Angle (Merck-Millipore). Након 24 сата инкубације на 37°C, извршено је стандардно бројање на плочама на Mueller-Hinton агар плочама. Сваки третман и временска тачка су извршени у три примерка, а бројање на плочама је поновљено за свако разблажење.
Кожа свињског стомака се добија од женских великих белих свиња у року од 15 минута од клања у складу са извозним стандардима Европске уније. Кожа је обријана и очишћена алкохолним марамицама, а затим замрзнута на -80°C током 24 сата ради девитализације коже. Након одмрзавања, комадићи коже од 1 цм2 су испрани три пута са PBS-ом, 0,6% натријум хипохлоритом и 70% етанолом по 20 минута сваки пут. Пре уклањања епидермиса, уклоните преостали етанол испирањем 3 пута у стерилном PBS-у. Кожа је култивисана на плочи са 6 бунарића са најлонском мембраном дебљине 0,45 μм (Merck-Millipore) на врху и 3 упијајућа јастучића (Merck-Millipore) који садрже 3 мл феталног говеђег серума (Sigma) допуњеног са 10% Дулбековог модификованог Игл медијума (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Колонијални биофилмови су узгајани као што је описано за студије изложености биофилму. Након култивације биофилма на мембрани током 72 сата, биофилм је нанет на површину коже помоћу стерилне инокулационе петље, а затим је мембрана уклоњена. Биофилм је затим инкубиран на дермису свиње додатних 24 сата на 37°C како би се биофилму омогућило да сазри и прилепи се за кожу свиње. Након што је биофилм сазрео и причврстио се, завој од 1,5 цм2, претходно навлажен стерилном дестилованом водом, нанет је директно на површину коже и инкубиран на 37°C током 24 сата. Виталне бактерије су визуализоване бојењем равномерним наношењем реагенса за виталност ћелија PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) на апикалну површину сваког експланта и инкубирањем током 5 минута. Користите дигиталну камеру Leica DFC425 за тренутно снимање слика на Leica MZ8 микроскопу. Подручја обојена ружичасто су квантификована коришћењем софтвера Image Pro верзије 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Скенирајућа електронска микроскопија је извршена као што је описано у наставку.
Бактерије узгајане преко ноћи разблажене су 1:100 у Милер-Хинтон бујону. 200 μl културе додато је на стерилну 0,2 μm Whatman циклопорну мембрану (Whatman, Мејдстон, УК) и посејано на Милер-Хинтон агар. Биофилм плоче су инкубиране на 37°C током 72 сата како би се омогућило формирање зрелог биофилма.
Након 3 дана сазревања биофилма, квадратни завој површине 3 цм2 је постављен директно на биофилм и инкубиран на 37°C током 24 сата. Након уклањања завоја са површине биофилма, на површину сваког биофилма је додато 1 мл реагенса за одрживост ћелија PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA) током 20 секунди. Површине су осушене пре него што су промене боје забележене помоћу дигиталног фотоапарата Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Припремити културе узгајане преко ноћи на Милер-Хинтон агару, пребацити појединачне колоније у 10 мл Милер-Хинтон бујона и инкубирати на мућкалици на 37°C (100 о/мин). Након инкубације преко ноћи, култура је разблажена 1:100 у Милер-Хинтон бујону и 300 µl је нането на кружну Вотман циклопорну мембрану од 0,2 µm (Whatman International, Мејдстон, УК) на Милер-Хинтон агару и инкубирано на 37°C у року од 72 сата. Зрели биофилм је нанет на рану као што је описано у наставку.
Сви радови са животињама су спроведени на Универзитету у Манчестеру у складу са пројектном лиценцом коју је одобрила Канцеларија за добробит животиња и етички преглед (P8721BD27) и у складу са смерницама које је објавило Министарство унутрашњих послова у складу са ревидираним ASPA из 2012. године. Сви аутори су се придржавали смерница за долазак. За све in vivo студије коришћени су осам недеља стари C57BL/6j мишеви (Envigo, Oxon, Велика Британија). Мишеви су анестезирани изофлураном (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Велика Британија), а њихове дорзалне површине су обријане и очишћене. Сваком мишу је затим дата ексцизиона рана величине 2 × 6 мм коришћењем Stiefel биопсијског бушача (Schuco International, Hertfordshire, Велика Британија). За ране инфициране биофилмом, нанесите 72-часовни колонијални биофилм узгајан на мембрани као што је горе описано на дермални слој ране користећи стерилну инокулациону петљу одмах након повреде и одбаците мембрану. Један квадратни центиметар завоја је претходно навлажен стерилном водом да би се одржало влажно окружење ране. Завоји су директно примењени на сваку рану и прекривени 3M Tegaderm фолијом (3M, Бракнел, Велика Британија) и течним лепком Mastisol (Eloquest Healthcare, Ферндејл, Мичиген) нанетим око ивица ради додатног пријањања. Бупренорфин (Animalcare, Јорк, Велика Британија) је примењен у концентрацији од 0,1 мг/кг као аналгетик. Мишеви су уништени три дана након повреде користећи метод из Распореда 1 и подручје ране је уклоњено, преполовљено и складиштено по потреби.
Бојење хематоксилином (ThermoFisher Scientific) и еозином (ThermoFisher Scientific) је извршено према протоколу произвођача. Површина ране и реепителизација су квантификоване коришћењем софтвера Image Pro верзије 10 (Media Cybernetics Inc, Роквил, Мериленд).
Пресеци ткива су девоскирани у ксилену (ThermoFisher Scientific, Лафборо, Велика Британија), рехидрирани са етанолом градијента 100–50% и кратко потопљени у дејонизовану воду (ThermoFisher Scientific). Имунохистохемија је извршена коришћењем VectaStain Elite ABC PK-6104 комплета (Vector Laboratories, Бурлингем, Калифорнија) према протоколу произвођача. Примарна антитела на неутрофиле NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) и макрофаге Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Вокингем, Велика Британија) су разблажена 1:100 у блокирајућем раствору и додата на површину реза, а затим су додата 2 антитела Anti-, VectaStain ABC и Vector Nova Red Peroxidase (HRP) супстратни комплет (Vector Laboratories, Бурлингем, Калифорнија) и контрабојена хематоксилином. Слике су снимљене помоћу микроскопа Olympus BX43 и дигиталног фотоапарата Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Велика Британија).
Узорци коже су фиксирани у 2,5% глутаралдехиду и 4% формалдехиду у 0,1 M HEPES-у (pH 7,4) током 24 сата на 4°C. Узорци су дехидрирани коришћењем градираног етанола и осушени у CO2 коришћењем Quorum K850 сушача критичних тачака (Quorum Technologies Ltd, Лафтон, УК) и пресвучени легуром злата и паладијума распршивањем коришћењем Quorum SC7620 мини система за распршивање/жарење. Узорци су снимљени коришћењем FEI Quanta 250 скенирајућег електронског микроскопа (ThermoFisher Scientific) да би се визуелизовала централна тачка ране.
Тото-1 јодид (2 μM) је примењен на површину исечене ране миша и инкубиран 5 минута на 37 °C (ThermoFisher Scientific) и третиран са Syto-60 (10 μM) на 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-минутне Z-stack слике су креиране помоћу Leica TCS SP8.
Биолошки и технички подаци о поновљеним узорцима су табеларно обрађени и анализирани коришћењем софтвера Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, Ла Хоја, Калифорнија). Једносмерна анализа варијансе са вишеструким поређењима коришћењем Данетовог post hoc теста коришћена је за тестирање разлика између сваког третмана и контролне облоге без антимикробних лекова. Вредност p <0,05 сматрана је значајном.
Ефикасност сребрних гел влакнастих облога прво је процењена на биофилмским колонијама Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa in vitro. Сребрни облози садрже различите формуле сребра: традиционални сребрни облози производе јоне Ag1+; сребрни облози, који могу да произведу јоне Ag1+ након додавања EDTA/BC, могу да униште матрицу биофилма и изложе бактерије сребру под антибактеријским дејством јона сребра15 и облози који садрже оксигенисане соли Ag које производе јоне Ag1+, Ag2+ и Ag3+. Његова ефикасност је упоређена са контролним облогом без антимикробног дејства направљеним од гелираних влакана. Преостале одрживе бактерије унутар биофилма процењиване су сваких 24 сата током 8 дана (Слика 1). Петог дана, биофилм је поново инокулиран са 3,85 × 105S Staphylococcus aureus или 1,22 × 105P aeruginosa да би се проценио опоравак биофилма. У поређењу са контролним завојима без антимикробних састојака, завоји са Ag1+ имали су минималан утицај на виталност бактерија у биофилмовима Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa током 5 дана. Насупрот томе, завоји који садрже оксигенисани Ag и Ag1+ + EDTA/BC соли били су ефикасни у убијању бактерија унутар биофилма у року од 5 дана. Након поновљене инокулације планктонским бактеријама 5. дана, није примећена обнова биофилма (Сл. 1).
Квантификација одрживих бактерија у биофилмовима Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa након третмана сребрним облогама. Колоније биофилма Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa третиране су сребрним облогама или контролним облогама без антимикробних састојака, а број преосталих одрживих бактерија одређен је сваких 24 сата. Након 5 дана, биофилм је реинокулиран са 3,85×105S. Staphylococcus aureus или 1,22×105P. Колоније бактериопланктона Pseudomonas aeruginosa формиране су појединачно како би се проценио опоравак биофилма. Графикони приказују средњу вредност +/- стандардну грешку.
Да би се визуализовао ефекат сребрних облога на одрживост биофилма, облози су примењени на зреле биофилмове узгајане на свињској кожи ex vivo. Након 24 сата, облог се уклања, а биофилм се боји плавом реактивном бојом, коју живе бактерије метаболишу у ружичасту боју. Биофилмови третирани контролним облозима били су ружичасти, што указује на присуство одрживих бактерија унутар биофилма (Слика 2А). Насупрот томе, биофилм третиран облогом Ag oxysols био је првенствено плав, што указује да су преостале бактерије на површини свињске коже биле неодрживе бактерије (Слика 2Б). Мешовита плава и ружичаста обојеност примећена је код биофилмова третираних облогама које садрже Ag1+, што указује на присуство одрживих и неодрживих бактерија унутар биофилма (Слика 2Ц), док су облози EDTA/BC који садрже Ag1+ били претежно плави са неким ружичастим мрљама, што указује на подручја која нису погођена сребрним облогом (Слика 2Д). Квантификација активних (ружичастих) и неактивних (плавих) подручја показала је да је контролни фластер био 75% активан (Слика 2Е). Ag1+ + EDTA/BC облози су деловали слично као и облози са оксигенисаним Ag солима, са стопама преживљавања од 13% и 14%, респективно. Ag1+ облог је такође смањио виталност бактерија за 21%. Ови биофилмови су затим посматрани помоћу скенирајуће електронске микроскопије (SEM). Након третмана контролним облогом и Ag1+ облогом, примећен је слој Pseudomonas aeruginosa који прекрива свињску кожу (слика 2F,H), док је након третмана Ag1+ облогом пронађено мало бактеријских ћелија и мало бактеријских ћелија испод њих. Колагена влакна се могу сматрати структуром ткива свињске коже (слика 2G). Након третмана Ag1+ + EDTA/BC облогом, видљиве су бактеријске плаке и плаке колагенских влакана испод њих (слика 2I).
Визуализација биофилма Pseudomonas aeruginosa након третмана сребрним завојем. (A–D) Бактеријска виталност у биофилмовима Pseudomonas aeruginosa узгајаним на свињској кожи визуализована је коришћењем PrestoBlue боје за виталност 24 сата након третмана сребрним завојима или неантимикробним контролним завојима. Живе бактерије су ружичасте, невиталне бактерије и свињска кожа су плаве. (E) Квантификација биофилмова Pseudomonas aeruginosa узгајаних на свињској кожи (ружичаста мрља) коришћењем скенирајуће електронске микроскопије Image Pro верзије 10 (FI) и третираних сребрним завојем или неантимикробним контролним завојем током 24 сата. SEM скала = 5 µm. (J–M) Колонијални биофилмови су расли на филтерима и обојени су реактивном бојом PrestoBlue након 24 сата инкубације са сребрним завојима.
Да би се утврдило да ли блиски контакт између завоја и биофилмова утиче на ефикасност завоја, колонијални биофилмови постављени на равну површину третирани су завојима 24 сата, а затим обојени реактивним бојама. Нетретирани биофилм је био тамно ружичасте боје (слика 2Ј). За разлику од биофилмова третираних завојима који садрже оксигенисане соли Ag (слика 2К), биофилмови третирани завојима који садрже Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC показали су траке ружичастог бојења (слика 2Л,М). Ова ружичаста обојеност указује на присуство одрживих бактерија и повезана је са подручјем шава унутар завоја. Ова ушивена подручја стварају мртве просторе који омогућавају бактеријама унутар биофилма да преживе.
Да би се проценила ефикасност сребрних облога in vivo, ране мишева инфицираних зрелим биофилмовима S. aureus и P. aeruginosa, искоришћене у пуној дебљини, третиране су контролним облогама без антимикробних састојака или сребрним облогама. Након 3 дана лечења, макроскопска анализа слике показала је мање величине рана када су третиране облогама са оксигенисаним солима у поређењу са контролним облогама без антимикробних састојака и другим сребрним облогама (слика 3A-H). Да би се потврдила ова запажања, ране су сакупљене, а површина ране и реепителизација су квантификоване на пресецима ткива обојеним хематоксилином и еозином коришћењем софтвера Image Pro верзије 10 (слика 3I-L).
Ефекат сребрних облога на површину ране и реепителизација рана инфицираних биофилмовима. (А–Х) Мале ћелије инфициране биофилмовима Pseudomonas aeruginosa (А–Д) и Staphylococcus aureus (Е–Х) након три дана третмана неантимикробним контролним облогом, облогом са оксигенисаном Ag сољу, облогом Ag1+ и облогом Ag1+. Репрезентативне макроскопске слике. ране мишева са Ag1+ + EDTA/BC облогом. (ИЛ) Репрезентативна инфекција Pseudomonas aeruginosa, хистолошки пресеци обојени хематоксилином и еозином, коришћени за квантификацију површине ране и регенерације епитела. Квантификација површине ране (М, О) и процентуална реепителизација (Н, П) рана инфицираних биофилмовима Pseudomonas aeruginosa (М, Н) и Staphylococcus aureus (О, П) (по групи за лечење n = 12). Графикони приказују средњу вредност +/- стандардну грешку. * значи p = < 0,05 ** значи p = < 0,01; Макроскопска скала = 2,5 mm, хистолошка скала = 500 µm.
Квантификација површине ране код рана инфицираних биофилмом Pseudomonas aeruginosa (слика 3M) показала је да су ране третиране Ag оксисолима имале просечну величину ране од 2,5 mm2, док је контролни завој без антимикробних састојака имао просечну величину ране од 3,1 mm2, што није тачно. достигла је статистичку значајност (слика 3M). p = 0,423). Ране третиране са Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC нису показале смањење површине ране (3,1 mm2 и 3,6 mm2, респективно). Третман завојем са оксигенисаним Ag солима подстакао је реепителизацију у већој мери него контролни завој без антимикробних састојака (34% и 15%, респективно; p = 0,029) и Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC (10% и 11%) (слика 3N). . , респективно).
Слични трендови у површини ране и регенерацији епитела примећени су код рана инфицираних биофилмовима S. aureus (слика 3О). Завоји који садрже оксигенисане соли сребра смањили су површину ране (2,0 мм2) за 23% у поређењу са контролним неантимикробним завојем (2,6 мм2), иако ово смањење није било значајно (p = 0,304) (слика 3О). Поред тога, површина ране у групи третираној Ag1+ је била благо смањена (2,4 мм2), док рана третирана Ag1+ + EDTA/BC завојем није смањила површину ране (2,9 мм2). Кисеонично-сребрне соли су такође у већој мери подстакле реепителизацију рана инфицираних биофилмом S. aureus (31%) него код оних третираних контролним завојима без антимикробних састојака (12%, p = 0,003) (слика 3П). Ag1+ завој (16%, p = 0,903) и Ag+1 + EDTA/BC завој (14%, p = 0,965) показали су нивое регенерације епитела сличне контролној групи.
Да би се визуализовао ефекат сребрних облога на матрицу биофилма, извршено је бојење Тото 1 и Сито 60 јодидом (Сл. 4). Тото 1 јодид је боја непропусна за ћелије која се може користити за прецизну визуализацију екстрацелуларних нуклеинских киселина, које су богате у ЕПС-у биофилмова. Сито 60 је боја пропусна за ћелије која се користи као контрабоја16. Посматрања Тото 1 и Сито 60 јодида у ранама инокулираним биофилмовима Pseudomonas aeruginosa (Слика 4A-D) и Staphylococcus aureus (Слика 4I-L) показала су да је након 3 дана третмана облогом, ЕПС у биофилму значајно смањен. Облоге које садрже оксигенисане соли Ag и Ag1+ + EDTA/BC. Ag1+ облози без додатних антибиофилмских компоненти значајно су смањили ДНК без ћелија у ранама инокулираним са Pseudomonas aeruginosa, али су били мање ефикасни у ранама инокулираним са Staphylococcus aureus.
Ин виво снимање биофилма ране након 3 дана третмана контролним или сребрним завојима. Конфокалне слике Pseudomonas aeruginosa (A–D) и Staphylococcus aureus (I–L) обојених са Toto 1 (зелено) за визуелизацију екстрацелуларних нуклеинских киселина, компоненте екстрацелуларних полимера биофилма. За бојење интрацелуларних нуклеинских киселина користите Syto 60 (црвено). киселине. П. Скенирајућа електронска микроскопија рана инфицираних биофилмовима Pseudomonas aeruginosa (E–H) и Staphylococcus aureus (M–P) након 3 дана третмана контролним и сребрним завојима. Скенирајући оквир SEM = 5 µm. Скенирајући оквир конфокалног снимања = 50 µm.
Скенирајућа електронска микроскопија је показала да су мишеви инокулирани биофилмским колонијама Pseudomonas aeruginosa (слика 4E-H) и Staphylococcus aureus (слика 4M-P) имали значајно мање бактерија у ранама након 3 дана третмана свим сребрним облогама.
Да би се проценио ефекат сребрних облога на упалу рана код мишева инфицираних биофилмом, пресеци рана инфицираних биофилмом третираних контролним или сребрним облогама током 3 дана су имунохистохемијски обојени коришћењем антитела специфичних за неутрофиле и макрофаге. Квантитативно одређивање неутрофила и макрофага изнутра. гранулационо ткиво. Слика 5). Сви сребрни облози смањили су број неутрофила и макрофага у ранама инфицираним Pseudomonas aeruginosa у поређењу са контролним облогама без антимикробних средстава након три дана третмана. Међутим, третман облогом са оксигенисаном сребрном сољу резултирао је већим смањењем неутрофила (p = <0,0001) и макрофага (p = <0,0001) у поређењу са другим тестираним сребрним облогама (Слика 5I,J). Иако је Ag1+ + EDTA/BC имао већи ефекат на биофилм ране, смањио је нивое неутрофила и макрофага у мањој мери него облог Ag1+. Умерене ране инфициране биофилмом S. aureus такође су примећене након превијања са Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) и Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) оксисолима у поређењу са контролном групом. Слични трендови су примећени и за неутропенију. (Слика 5K). Међутим, само је превија са оксигенисаном Ag сољу показала значајно смањење броја макрофага у гранулационом ткиву у поређењу са контролном групом код рана инфицираних биофилмовима S. aureus (p = 0,0339) (Слика 5L).
Неутрофили и макрофаги су квантификовани у ранама инфицираним биофилмовима Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus након 3 дана третмана контролним завојима без антимикробних састојака или сребрним завојима. Неутрофили (AD) и макрофаги (EH) су квантификовани у пресецима ткива обојеним антителима специфичним за неутрофиле или макрофаге. Квантификација неутрофила (I и K) и макрофага (J и L) у ранама инфицираним биофилмовима Pseudomonas aeruginosa (I и J) и Staphylococcus aureus (K и L). N = 12 по групи. Графикони приказују средњу вредност +/- стандардну грешку, значајне вредности у поређењу са контролним завојем без антибактеријских састојака, * значи p = < 0,05, ** значи p = < 0,01; *** значи p = < 0,001; означава p = < 0,0001).
Затим смо проценили ефекат сребрних облога на зарастање независно од инфекције. Неинфициране ексцизионе ране су третиране контролним облогом без антимикробних састојака или сребрним облогом током 3 дана (Слика 6). Међу тестираним сребрним облогама, само ране третиране облогом са оксигенисаном сољу изгледале су мање на макроскопским сликама него ране третиране контролном групом (Слике 6А-Д). Квантификација површине ране помоћу хистолошке анализе показала је да је просечна површина ране након третмана облогом Ag oxysols била 2,35 мм2 у поређењу са 2,96 мм2 за ране третиране контролном групом, али ова разлика није достигла статистичку значајност (p = 0,488) (Слика 6И). Насупрот томе, није примећено смањење површине ране након третмана облогом Ag1+ (3,38 мм2, p = 0,757) или Ag1+ + EDTA/BC (4,18 мм2, p = 0,054) у поређењу са контролном групом. Повећана регенерација епитела је примећена са Ag оксисол завојем у поређењу са контролном групом (30% наспрам 22%, респективно), иако ово није достигло значајност (p = 0,067), ово је прилично значајно и потврђује претходне резултате. Завој са оксисолима подстиче реепителизацију. -Епителизација неинфицираних рана17. Насупрот томе, третман са Ag1+ или Ag1+ + EDTA/BC завојима није имао ефекта или је показао смањену реепителизацију у поређењу са контролом.
Утицај сребрног завоја за ране на зарастање рана код неинфицираних мишева са потпуном ресекцијом. (AD) Репрезентативне макроскопске слике рана након три дана третмана контролним завојем без антимикробних састојака и сребрним завојем. (EH) Репрезентативни пресеци ране обојени хематоксилином и еозином. Квантификација површине ране (I) и проценат реепителизације (J) израчунати су из хистолошких пресека на средини ране коришћењем софтвера за анализу слика (n = 11–12 по групи за третман). Графикони приказују средњу вредност +/- стандардну грешку. * значи p = <0,05.
Сребро има дугу историју употребе као антимикробна терапија у зарастању рана, али многе различите формулације и методе испоруке могу довести до разлика у антимикробној ефикасности 18. Штавише, својства антибиофилма специфичних система за испоруку сребра нису у потпуности схваћена. Иако је имуни одговор домаћина релативно ефикасан против планктонских бактерија, генерално је мање ефикасан против биофилмова 19. Планктонске бактерије се лако фагоцитују макрофагима, али унутар биофилмова, агрегиране ћелије представљају додатне проблеме ограничавајући одговор домаћина до те мере да имуне ћелије могу да подлегну апоптози и ослободе проинфламаторне факторе како би појачале имуни одговор 20. Примећено је да неки леукоцити могу да продру кроз биофилмове 21, али нису у стању да фагоцитују бактерије када је ова одбрана угрожена 22. Требало би користити холистички приступ како би се подржао имуни одговор домаћина против инфекције биофилма ране. Дебридман ране може физички пореметити биофилм и уклонити већину биотерећења, али имуни одговор домаћина може бити неефикасан против преосталог биофилма, посебно ако је имуни одговор домаћина угрожен. Стога, антимикробне терапије као што су сребрни облози могу подржати имуни одговор домаћина и елиминисати инфекције биофилма. Састав, концентрација, растворљивост и супстрат за испоруку могу утицати на антимикробну ефикасност сребра. Последњих година, напредак у технологији обраде сребра учинио је ове облоге ефикаснијим9,23. Како технологија сребрних облога напредује, важно је разумети ефикасност ових облога у контроли инфекције ране и, што је још важније, утицај ових снажних облика сребра на околину ране и зарастање.
У овој студији, упоредили смо ефикасност два напредна сребрна завоја са конвенционалним сребрним завојима који производе Ag1+ јоне против биофилмова користећи различите in vitro и in vivo моделе. Такође смо проценили ефекат ових завоја на околину ране и зарастање независно од инфекције. Да би се минимизирао утицај матрице за испоруку, сви тестирани сребрни завоји су били састављени од карбоксиметилцелулозе.
Наша прелиминарна евалуација ових сребрних облога против колонијалних биофилмова Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus показује да, за разлику од традиционалних Ag1+ облога, два напредна сребрна облога, Ag1+ + EDTA/BC и оксигенисане Ag соли, ефикасно делују у концентрацији од 5 до 100 мг. Ефикасно убијају бактерије биофилма у року од неколико дана. Поред тога, ови облози спречавају поновно формирање биофилма након поновљеног излагања планктонским бактеријама. Ag1+ облога је садржала сребро хлорид, исто једињење сребра и основну матрицу као Ag1+ + EDTA/BC, и имала је ограничен ефекат на виталност бактерија унутар биофилма током истог периода. Запажање да је Ag1+ + EDTA/BC облога била ефикаснија против биофилма од Ag1+ облоге која се састоји од исте матрице и једињења сребра подржава идеју да су потребни додатни састојци да би се повећала ефикасност сребро хлорида против биофилма, као што је већ објављено на другим местима15. Ови резултати подржавају идеју да BC и EDTA играју додатну улогу која доприноси укупној ефикасности завоја и да је одсуство ове компоненте у Ag1+ завојима могло допринети неуспеху у демонстрирању ефикасности in vitro. Открили смо да завоји са оксигенисаним Ag солима који производе Ag2+ и Ag3+ јоне показују јачу антибактеријску ефикасност од Ag1+ и на нивоима сличним Ag1+ + EDTA/BC. Међутим, због високог редокс потенцијала, није јасно колико дуго Ag3+ јони остају активни и ефикасни против биофилмова рана и стога заслужују даља истраживања. Поред тога, постоји много различитих завоја који генеришу Ag1+ јоне, а који нису тестирани у овој студији. Ови завоји су састављени од различитих једињења сребра, концентрација и базних матрица, што може утицати на испоруку Ag1+ јона и њихову ефикасност против биофилмова. Такође је вредно напоменути да постоји много различитих in vitro и in vivo модела који се користе за процену ефикасности завоја за ране против биофилмова. Врста модела који се користи, као и садржај соли и протеина у медијуму који се користи у овим моделима, утицаће на ефикасност завоја. У нашем ин виво моделу, дозволили смо биофилму да сазри ин витро, а затим смо га пренели на дермалну површину ране. Имуни одговор домаћина миша је релативно ефикасан против планктонских бактерија примењених на рану, чиме се формира биофилм док рана зараста. Додавање зрелог биофилма рани ограничава ефикасност имуног одговора домаћина на формирање биофилма тако што омогућава зрелом биофилму да се успостави унутар ране пре него што почне зарастање. Стога, наш модел нам омогућава да проценимо ефикасност антимикробних завоја на зрелим биофилмовима пре него што ране почну да зарастају.
Такође смо открили да приањање завоја утиче на ефикасност сребрних завоја на ин витро узгајаним биофилмовима и свињској кожи. Блиски контакт са раном се сматра кључним за антимикробну ефикасност завоја24,25. Завоји који садрже оксигенисане соли сребра били су у блиском контакту са зрелим биофилмовима, што је резултирало значајним смањењем броја одрживих бактерија унутар биофилма након 24 сата. Насупрот томе, када су третирани завојима Ag1+ и Ag1+ + EDTA/BC, значајан број одрживих бактерија је остао. Ови завоји садрже шавове дуж целе дужине завоја, што ствара мртве просторе који спречавају блиски контакт са биофилмом. У нашим ин витро студијама, ова подручја без контакта спречила су убијање одрживих бактерија унутар биофилма. Проценили смо одрживост бактерија тек након 24 сата третмана; Временом, како завој постаје засићенији, може бити мање мртвог простора, смањујући површину за ове одрживе бактерије. Међутим, ово истиче важност састава завоја, а не само врсте сребра у завоју.
Иако су ин витро студије корисне за поређење ефикасности различитих технологија сребра, такође је важно разумети ефекте ових завоја на биофилмове ин виво, где ткиво домаћина и имуни одговори доприносе ефикасности завоја против биофилмова. Ефекат ових завоја на биофилмове рана је посматран коришћењем скенирајуће електронске микроскопије и EPS бојења биофилма коришћењем интрацелуларних и екстрацелуларних ДНК боја. Открили смо да су након 3 дана третмана сви завоји били ефикасни у смањењу ДНК без ћелија у ранама инфицираним биофилмом, али је Ag1+ завој био мање ефикасан код рана инфицираних Staphylococcus aureus. Скенирајућа електронска микроскопија је такође показала да је значајно мање бактерија било присутно у ранама третираним сребрним завојима, иако је то било израженије код завоја са оксигенисаном Ag сољу и Ag1+ + EDTA/BC завоја у поређењу са Ag1+ завојем. Ови подаци показују да су тестирани сребрни завоји имали различите степене утицаја на структуру биофилма, али ниједан од сребрних завоја није био у стању да искорени биофилм, што подржава потребу за холистичким приступом лечењу инфекција биофилма рана; употреба сребрних трака за руке. Лечењу претходи физички дебридман како би се уклонио већи део биофилма.
Хроничне ране су често у стању тешке упале, при чему вишак инфламаторних ћелија остаје у ткиву ране током дужег временског периода, узрокујући оштећење ткива и исцрпљујући кисеоник потребан за ефикасан ћелијски метаболизам и функцију у рани26. Биофилмови погоршавају ово непријатељско окружење ране негативно утичући на зарастање на различите начине, укључујући инхибицију пролиферације и миграције ћелија и активацију проинфламаторних цитокина27. Како сребрни облози постају ефикаснији, важно је разумети њихов утицај на окружење ране и зарастање.
Занимљиво је да, иако су сви сребрни облози утицали на састав биофилма, само облози са оксигенисаним сребрним солима повећали су реепителизацију ових инфицираних рана. Ови подаци подржавају наше претходне налазе17 и налазе Калана и др. (2017)28, који су показали добре профиле безбедности и токсичности оксигенисаних сребрних соли, јер су ниже концентрације сребра биле ефикасне против биофилмова.
Наша тренутна студија истиче разлике у технологији сребра између антимикробних сребрних завоја и утицај ове технологије на окружење ране и зарастање независно од инфекције. Међутим, ови резултати се разликују од претходних студија које показују да је Ag1+ + EDTA/BC завој побољшао параметре зарастања повређених зечјих ушију in vivo. Међутим, то може бити због разлика у животињским моделима, временима мерења и методама примене бактерија29. У овом случају, мерења ране су обављена 12 дана након повреде како би се омогућило да активни састојци завоја делују на биофилм током дужег временског периода. Ово је поткрепљено студијом која је показала да су клинички инфицирани чиреви на нози третирани са Ag1+ + EDTA/BC у почетку повећани након једне недеље лечења, а затим током наредне 3 недеље лечења са Ag1+ + EDTA/BC и у року од 4 недеље употребе не-антимикробних лекова. CMC завоји за смањење величине чирева30.
Раније је показано да су одређени облици и концентрације сребра цитотоксични in vitro 11, али ови in vitro резултати не доводе увек до нежељених ефеката in vivo. Поред тога, напредак у технологији сребра и боље разумевање једињења сребра и концентрација у завојима довели су до развоја многих безбедних и ефикасних сребрних завоја. Међутим, како технологија сребрних завоја напредује, важно је разумети утицај ових завоја на околину ране 31, 32, 33. Раније је објављено да повећана стопа реепителизације одговара повећаном уделу антиинфламаторних М2 макрофага у поређењу са проинфламаторним М1 фенотипом. Ово је примећено у претходном моделу на мишу где су завоји за ране од сребрног хидрогела упоређени са сребрним сулфадиазином и неантимикробним хидрогеловима 34.
Хроничне ране могу показивати прекомерну упалу и примећено је да присуство вишка неутрофила може бити штетно за зарастање рана35. У студији на мишевима са смањеним бројем неутрофила, присуство неутрофила је одложило реепителизацију. Присуство вишка неутрофила доводи до високих нивоа протеаза и реактивних врста кисеоника, као што су супероксид и водоник-пероксид, који су повезани са хроничним и споро зарастајућим ранама37,38. Слично томе, повећање броја макрофага, ако је неконтролисано, може довести до одложеног зарастања рана39. Ово повећање је посебно важно ако макрофаги нису у стању да пређу из проинфламаторног фенотипа у про-зарастајући фенотип, што резултира тиме да ране не успевају да изађу из инфламаторне фазе зарастања40. Приметили смо смањење неутрофила и макрофага у ранама инфицираним биофилмом након 3 дана третмана свим сребрним облогама, али је смањење било израженије код облога са оксигенисаном сољу. Ово смањење може бити директна последица имуног одговора на сребро, одговора на смањено биолошко оптерећење или тога што је рана у каснијој фази зарастања и стога је број имуних ћелија у рани смањен. Смањење броја инфламаторних ћелија у рани може одржати окружење погодно за зарастање рана. Механизам деловања како Ag оксисоли подстичу зарастање независно од инфекције није јасан, али способност Ag оксисоли да производе кисеоник и уништавају штетне нивое водоник-пероксида, медијатора упале, може објаснити ово и захтева даља истраживања17.
Хроничне, незарастајуће инфициране ране представљају проблем и за лекаре и за пацијенте. Иако многи завоји тврде да имају антимикробну ефикасност, истраживања се ретко фокусирају на друге кључне факторе који утичу на микроокружење ране. Ова студија показује да различите технологије сребра имају различиту антимикробну ефикасност и, што је важно, различите ефекте на окружење ране и зарастање, независно од инфекције. Иако ове ин витро и ин виво студије показују ефикасност ових завоја у лечењу инфекција рана и подстицању зарастања, потребна су рандомизована контролисана испитивања како би се проценила ефикасност ових завоја у клиници.
Скупови података коришћени и/или анализирани током текуће студије доступни су од одговарајућег аутора на разуман захтев.
Време објаве: 15. јул 2024.